琼脂糖凝胶电泳步骤
琼脂凝胶电泳操作应注意哪些环节？
琼脂糖凝胶电泳操作应注意哪些环节？
一。操作步骤： 1、电泳方法 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳；如果需要高分辨率的电泳，特别是只有少数bp应选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；使用普通电泳是不合适的DNA应使用脉冲凝胶电泳。 2、凝胶浓度 琼脂糖凝胶电泳浓度通常为0.5～2\\在%之间，低浓度用于大片段核酸电泳，高浓度用于小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决方案。 3、缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE具有更好的缓冲能力。使用新的缓冲液可以显著提高电泳效果。 4、电压和温度 电泳时，电场强度不应超过20V/cm，电泳温度应低于30℃，对于巨大的DNA温度应低于15℃。 5、DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量过高，含有杂质的蛋白质会导致条带模糊和条带缺失。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白质。 6、DNA的上样 正确的DNA上样是条带的明确保证。注意太多的DNA可能导致上样量DNA带型模糊，但太小DNA上样导致弱信号甚至缺失。 7、Marker的选择 DNA必须使用电泳DNA Marker或者是已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择目标片段大小附近ladder比较密集，所以对目标片段大小的估计比较准确。 8、染色和观察凝胶 核酸染色剂常用于实验室（EB），染色效果好，操作方便，但稳定性差，有毒。观察凝胶时，应根据染料的不同使用适当的光源和激发波长。如果激发波长不正确，就不容易观察到条带，导致条带模糊。 二、注意事项： 1、巨大的DNA普通电泳链条可能跑不出胶孔，导致缺带。 2.高浓度的胶水可能会使分子大小相似DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 3、多次使用电泳缓冲液后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能导致DNA电泳产生模糊和不规则的条带DNA带迁移现象。 4.如果电泳时电压和温度过高，可能会导致条带模糊和不规则DNA带迁移现象。特别是电压过大可能导致小片段脱胶和缺带现象。 5、变性的DNA样品可能导致条带模糊和丢失，或不规则DNA条带迁移。在上样之前不要对DNA加热样品，用20mM NaCl可以防止缓冲液稀释DNA变性。 6、太多的DNA可能导致上样量DNA带型模糊，但太小DNA上样导致弱信号甚至缺失。 来源：-琼脂糖凝胶电泳