primer默认的引物长度可以转变吗
DNA复制时的引物成分是什么?作用机理是什么?
DNA复制时的引物成分是什么?作用机理是什么?
DNA半保留复制:当DNA进行复制时,双螺旋结构解开成两条单链,各自作为模板合成与之互补的新链。在子代DNA双链中,一条是来自于亲代,另一条完全重新合成 。
DNA复制,需要许多相关的酶和蛋白因子参与。包括:①底物(substrate) :dATP,dGTP,dCTP,dTTP;②DNA聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶,简写为DNA-pol;③模板(template) :解开成单链的DNA母链;④引物(primer) :一小段RNA;⑤其他的酶和蛋白质因子:DNA旋转酶, 解旋酶, DNA结合蛋白;引物酶;DNA连接酶。
参与DNA复制的DNA聚合酶,必须以一段具有3端自由羟基(3-OH)的RNA作为引物(primer) ,才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小,通常为1-10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序,与其模板DNA的碱基顺序相配对。
作用机理:在模板的复制起始部位催化NTP的聚合 , 形成短片段的RNA。这一小段RNA作为复制的引物(primer),提供3-OH末端,使DNA-pol能够催化dNTP聚合。引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物。由此开始DNA的复制。
PCR的退火温度怎么设定?
PCR中退火的那步是引物与模板结合,一般来说,退火温度比Tm值要低上5度左右。另外,也可以根据你设计引物的软件比如primer5.0或Olige 6 推荐的温度。但这些都不是绝对的。
你要是在他的推荐温度下没有目的条带,你可以试试做一个温度梯度,摸索一下退火温度。
怎样根据mRNA设计引物?
先找到基因的mRNAX序列。
引物设计参数:
a
引物长度一般在20bp左右,上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。
b
引物退火温度一般在58度,不同软件TM使用不同的算法,primer3,primer
5,primer
6,primer
express等一般可以设置在55-58度,beacon
design可以设置在65左右。
c
GC含量一般没什么特殊要求,40-60最好,如果不好设计,30-80也是可以的。
d
产物长度在100-150,80-200也可以,不要在50bp左右,那样和引物二聚体不好区分,超过200bp可能会影响PCR扩增。
e
软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配,特别是3`端不能有碱基匹配,那样更容易形成二聚体。
f
引物设计好以后,在NCBI上做一个primer-blast,检测一下是否有非特异性扩增。