酵母rna的提取及含量测定注意事项
在RNA提取过程中需要注意哪些方面以防止RNA的降解啊?
在RNA提取过程中需要注意哪些方面以防止RNA的降解啊?
因为自然界(实验室)普遍存在RNA酶,提取时需要注意几点:
1、所用试剂、耗材需用DEPC水浸泡然后高压灭菌2、实验时戴口罩,主要是防止呼吸、说话时RNA酶进入试剂中3、实验台保持清洁、降低环境RNA酶4、RNA提取后,放入-80摄氏度保存,防止降解
rna提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?
注意枪头管子里的RNA酶,注意你唾沫星子皮肤上存在的RNA酶,注意各种试剂中存在的RNA酶。
重要的事情说三遍。
剩下就是最后一步吸干点,吹干点,但别吹太过了。
RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?
细胞中的RNA主要有三类:rRNA约占80%-85%,tRNA和核内小分子RNA约占10-15,mRNA约占1-5,由于rRNA占绝大多数,因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rRNA,它也有三种类型:28S,18S,5S。所以我们看到的也应该是三条带,而且28S的亮度为18S的两倍。这样的RNA才可以用来建库。
在RNA的提取时,一定要注意RNase的污染,因RNA极易被RNase的降解,操作时应尽量少说话,并在洁净的环境中操作,主要防止手、唾液和空气中Rnase的污染;另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5TPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase,,可以不经处理直接用于提取RNA,实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有Rnase污染,使用前必须180度干烤8小时或更长时间(玻璃器皿)或用氯仿冲洗(塑料制品),另外,由于材料不同,机体内含有的糖、酚类物质不一样,因此材料不同用的方法也应该不一样。
下面是两种提取方法,第一种适用于嫩组织或动物组织的总RNA的提取,第二种适用于老组织的提取。
试剂:提取缓冲液,KAc(5M), 异丙醇,无水乙醇,DEPC水
仪器:离心机,恒温水浴锅,研钵
方法一 动物、植物(嫩叶)的总RNA分离
大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨
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加5mlTrizol裂解液
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12000rpm ,4度,10分钟
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加入1ml氯仿
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剧烈振荡15秒,室温温育2-3分钟
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室温离心10分钟,8000rpm
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取上清,加入等体积的异丙醇,15-30度放置10分钟。
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12000g离心10分钟
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弃上清,加入10ml75洒精洗沉淀。
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2-8度下,不超过7500g离心5分钟
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弃上清,干燥沉淀10分钟
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用DEPC水溶。
方法二 、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总RNA分离
1g组织液氮研磨,加入6ML提取缓冲液
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2min振荡
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65℃,20min
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加入1.5MLKAc
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混匀,冰浴20min
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8000rpm,4℃,15min
取上清,加入0.6倍异丙醇,-20℃,1小时(或室温15-20min)
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12000rpm,4℃,15min
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75乙醇,12000rpm,20℃,5min
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晾干,溶60ulDEPC水,15min
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12000rpm,4℃,5min, 上清即为RNA。