如何保证引物设计正确
引物设计基本原理？
引物设计基本原理？
引物设计有3 条基本原
首先引物与模板的序列要紧密互补。
其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。
再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) 。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度(primer length)，产物长度(productlength) ，序列Tm 值(melting temperature) ，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability ，用ΔG值反映) ，形成引物二聚体(primer dimer) 及发夹结构(du2plex formation and hairpin) 的能值,在错配位点(falsepriming site) 的引发效率，引物及产物的GC 含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
PCR设计引物的时候为什么酶切位点通常放在引物的近5’端？
因为酶切位点的那几个碱基通常是跟模板不匹配的，如果本来就是匹配序列，放在什么位置都可以
pr荧光引物设计原则？
引物设计有 3 条基本原则：
引物与模板的序列要紧密互补。
引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。
再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
引物设计
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。
在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 ?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
设计要求
做Real Time时,用于SYp Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
避免重复碱基，尤其是G。
Tm58-60度。
GC30-80%。
3#39端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。
正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
引物的退火温